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实时荧光定量PCR步骤详解

2022-08-27 11:04:58

实时荧光定量PCR步骤详解

实时荧光定量PCR仪

样本RNA的抽提

1、取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

2、两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

3、RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4、RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。

5、RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

6、溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

RNA质量检测

紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。

1、浓度测定

A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(ug/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 ug/ml。具体计算如下:

RNA溶于40 ul DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495 ul的TE中,测得A260 = 0.21

RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ul,剩余RNA总量为:

35 ul × 0.84 ug/ul = 29.4 ug

2、纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。

变性琼脂糖凝胶电泳测定

1、制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度 成分:

0.4M MOPS,pH 7.0

0.1M 乙酸钠

0.01M EDTA

灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 ul溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。


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