新闻资讯

新闻中心

当前位置: 首页 > 新闻中心 > 行业资讯

实时荧光定量PCR (qPCR)实验操作流程及注意事项

2022-08-17 09:42:00

实时荧光定量PCR (qPCR)实验操作流程

实验原理:

实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。

实时荧光定量PCR仪

因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首 次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。相反,终点法检测(也称“读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

实验准备:

cDNA模板、引物、qPCR mix、ddH2O等。

实验步骤:

1.配样

按照实验需要对cDNA模板加水作适当稀释,涡旋混匀后离心,根据实际所检测样品和基因的数量计算加样体系,按照体系以此加入ddH2O,qPCR mix,引物,配成一管mix,涡旋混匀,后离心。准备适量的qPCR八连排板或者96孔板,在这里我们用的是八连排管,置于冰上操作,将上步混匀的mix按每孔19μL加入到八连排孔中。

2.加模板

在每个孔各加入1μL的cDNA模板。加样完毕后,盖上八连排管盖,注意尽量从孔边上压紧管盖。涡旋混匀后离心,去除气泡。

3.上机反应

上机前先设置程序,具体如下:设置反应温度,设置孔板信息,样品放入仪器中,开始反应。

4.导出数据

反应结束后得到qPCR数据,根据溶解曲线,查看数据的有效性,导出数据为EXCEL文件并保存。

5.实验结束

实验完毕,打开qPCR仪,取出八连排管,盖上qPCR仪,关闭电脑,仪器。

注意事项:

1.由于分装过程中,吸头具有表面张力,会导致样品损耗,因此根据实际需要,多配一些。

2.实验中用移液枪时注意保持相同的力度。匀速吸打。

3.操作应于冰上进行,防止因操作时间过长,影响酶活性。


下一篇:哪种Taq酶更适合您?2022-08-20

近期浏览:

相关产品

相关新闻

地点:河北省石家庄市高新区科技中心

业务热线:186-3213-6937    

总部电话:0311-82970259         

邮箱:sanshibio@126.com