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实时荧光定量PCR技术

2022-09-17 17:02:22

实时荧光定量PCR技术概念

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR),又名定量PCR,是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。它通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

实时荧光定量PCR仪

实时荧光定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。

实时荧光定量PCR技术原理

它的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术优点

a.可进行准确的定量检测,实时性和准确性好;

b.定量范围宽;

c.灵敏度高;

d.特异性和可靠性更强,克服了假阳性;

e.操作简单快速,无 污染,无须后处理和电泳检测;

f.安 全,技术易于学习,易于进行电脑化数据管理;

g.目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

PCR反应基本步骤

a.变性:通过加热使模板DNA双链之间的氢键断裂,双链分开而成单链的过程,高温使双链DNA解离形成单链(94℃,30s)。

b.退火:当温度降低时,引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子,低温下,引物与模板DNA互补区结合(55℃,30s)。

c.延伸:在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链,中温延伸,DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(70-72℃,30-60s)。

以上述三个步骤为一个循环,每一循环的产物均可作为下一个循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n的形式增加。


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